Podstawowe informacje na temat PCR/zestawów do PCR
Łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR) jest reakcją biochemiczną, w wyniku której dochodzi do amplifikacji pojedynczej cząsteczki DNA i, w efekcie powtarzania poszczególnych etapów, do wytworzenia milionów kopii w bardzo krótkim czasie.
Synteza DNA zachodzi w trzech głównych etapach:
- denaturacja jest to proces, w którym podwójna nić DNA jest rozdzielana na pojedyncze nici pod wpływem ogrzewania;
- przyłączanie starterów, w tym kroku potrzebne są startery, czyli krótkie syntetyzowane oligonukleotydy DNA, które wiążą się z docelowym locus DNA;
- wydłużanie łańcucha, na tym etapie polimeraza DNA Taq wydłuża odpowiedni koniec 3’ startera zgodnie z nicią szablonu i tworzy podwójną nić DNA.
Ponieważ PCR jest bardzo złożoną i wymagającą reakcją, obecnie są dostępne komercyjne, gotowe do użycia zestawy do PCR w przystępnej cenie do badań naukowych lub diagnostyki medycznej. Zestawy do PCR są zoptymalizowane pod kątem określonych warunków, co pomaga badaczom w redukcji pipetowania i ryzyka zanieczyszczenia, jak również oszczędzają czas, dozowanie, możliwe zmiany i błędy w pojedynczej reakcji PCR, zestawy do PCR stają się idealnym rozwiązaniem w aplikacjach o wysokiej wydajności i testach diagnostycznych.
Czym są odczynniki PCR?
Zestawy do PCR, znane również jako PCR master mix, super mix lub ready mix, stanowią mieszaninę odczynników do PCR. Zestaw do PCR zazwyczaj składa się z polimerazy DNA, dNTP, kofaktorów (MgCl2), starterów, dNTP i zoptymalizowanego buforu lub innych dodatkowych odczynników w optymalnych stężeniach, które można ze sobą mieszać. Jego określona objętość może być rozdzielona pomiędzy probówki PCR, paski lub płytki i dodana do szablonu DNA w zależności od zastosowania. Zestaw do PCR może służyć jako bardzo użyteczne narzędzie w takich zastosowaniach jak: amplifikacja szablonu DNA do sekwencjonowania i klonowania, mutageneza, generowanie bibliotek, profilowanie ekspresji genów i amplifikacja kilku genów/fragmentów jednocześnie.
Jaka polimeraza jest używana do PCR?
Jednym z kluczowych składników zestawów do PCR jest polimeraza DNA. Polimeraza DNA powszechnie stosowana w zestawach do PCR jest wyizolowana z termofilnej bakterii Thermus aquaticus polimeraza Taq. Różne modyfikacje genetyczne polimerazy Taq, w tym polimerazy DNA typu hot-start, polimerazy DNA o odwrotnej transkrypcji, stwarzają podstawy do zastosowania zestawów do PCR w obszarach naukowo-badawczych oraz zwiększają możliwości zastosowania zestawów PCR w diagnostyce medycznej.
Większość dostępnych komercyjnych zestawów do PCR zawierających zmodyfikowaną polimerazę DNA przeznaczona jest do określonego typu PCR dostosowanego do określonego typu termocyklera. Jako przykład można podać PCR w czasie rzeczywistym (znany również jako ilościowy PCR lub qPCR).
Co można zrobić za pomocą PCR?
Powszechne zestawy do PCR znajdują zastosowanie w:
– rutynowych PCR do amplifikacji i klonowania;
– kolonijnych PCR;
– zagnieżdżonych PCR;
– PCR o wysokiej wydajności w genotypowaniu lub diagnostyce;
– multipleks PCR;
– sekwencjonowaniu nowej generacji (NGS);
– qPCR;
– RT-qPCR;
– jednoetapowych PCR;
– Droplet PCR.